Nr. 21 / 1. September 2017

Zelle für Zelle den Beginn des Lebens rekonstruieren


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Ein virtueller Embryo. Das Online-Tool bietet Forscherinnen und Forschern eine einfache Möglichkeit, sich Transkriptom jeder einzelnen Zelle eines Drosphila-Embryonen anzuschauen. Die Expression verschiedener Gene ist mit verschiedenen Farben markiert.

Abbildung: Drosophila Virtual Expression eXplorer, BIMSB am MDC

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Mithilfe des virtuellen Embryos sind Vorhersagen möglich, in welchen Zellen zum Beispiel die Gene even skipped (in rot) und twist (grün) angeschaltet sind. Um die räumliche Verteilung genau einzuschätzen, können Forscherinnen und Forscher den Taufliegen-Embryo von allen Seiten anschauen.

Abbildung: Drosophila Virtual Expression eXplorer, BIMSB am MDC.

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Ob die Vorhersagen des Algorithmus korrekt waren, überprüften die Forscher im Experiment mit Taufliegen-Embryonen. Die DNS in den Zellkernen ist in diesem Bild blau angefärbt. Dadurch ist die Morphologie des Embryos erkennbar. Auf der linken Seite setzt sich gerade der Kopf vom Rest des Körpers ab, in der Mitte beginnt eine Einstülpung – diese beiden Merkmale sind charakteristisch für Embryonen in dieser Entwicklungsphase. Rot leuchten die Stellen, an denen das Gen DsRed aktiv ist. Das Experiment spiegelt die Vorhersage wider.

Foto: Philipp Wahle, BIMSB am MDC

Das virtuelle Modell eines Taufliegen-Embryos zeigt in bisher ungekannter räumlicher Auflösung, in welchen Zellen welche Gene aktiv sind. Über eine interaktive Datenbank-Oberfläche können Forscherinnen und Forscher eine Blaupause der frühen embryonalen Entwicklung erkunden.

Wenn sich das befruchtete Taufliegen-Ei 13 Mal geteilt hat, besteht es aus etwa 6.000 Zellen. Unter dem Mikroskop sehen sie alle gleich aus. Dennoch weiß jede Zelle des Drosophila melanogaster-Embryos, ob sie eine Nerven- oder eine Muskelzelle werden wird – beziehungsweise Teil des Darms, des Kopfes oder des Hinterteils. Nun haben die Teams um Nikolaus Rajewsky und Robert Zinzen vom Berlin Institute of Medical Systems Biology (BIMSB) am Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC) die jeweils einzigartigen Genexpressionsprofile dieser Zellen analysiert und die gewonnenen Daten mithilfe eines neuen Algorithmus räumlich kartiert. Das Ergebnis ist ein virtueller Embryo, der genau zeigt, welche Gene zu diesem Zeitpunkt an welcher Stelle aktiv sind. „Im Grunde genommen ist es eine Blaupause für die frühe Entwicklung“, sagt Robert Zinzen, der Leiter der Forschungsgruppe „Systembiologie der Differenzierung von neuronalen Zellen und Geweben“. Die Studie erscheint als First Release in der Online-Ausgabe der Fachzeitschrift Science.

„Es ist erst seit kurzem möglich, in großem Maßstab die Genexpression für das gesamte Erbgut in einzelnen Zellen zu untersuchen. Nikolaus hat das Potenzial dieser Technologie früh erkannt und es in seinem Labor etabliert“, sagt Zinzen. „Dann hat er überlegt, ob die Einzelzell-Transkriptom-Daten allein ausreichen könnten, um für komplex aufgebaute Gewebe räumliche Muster der Genexpression für das gesamte Erbgut zu errechnen.“ Es stellte sich heraus, dass das BIMSB nicht nur das perfekte Modell-System hat – den Drosophila-Embryo – sondern auch die richtigen Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler mit der richtigen Expertise zusammenbringt, von Physik und Mathematik bis hin zu Biochemie und Entwicklungsbiologie. Da die Lösung vieler biologischer Probleme die Entwicklung neuer computergestützter Analyseverfahren, eine entsprechende Expertise und Rechenkapazität erfordert, vereint das Institut seit seiner Gründung Labore mit unterschiedlichen fachlichen Hintergründen.

Die Gleichzeitigkeit der ersten Zellteilungen durchbrechen

Nikolaus Rajewsky hat es Spaß gemacht, 15 Jahre nach seiner Zeit als Post-Doc an der Rockefeller University zur Entwicklung der Taufliege und den Gen-regulatorischen Elementen in Drosophila-Embryonen zurückzukehren. „Der virtuelle Embryo ist viel mehr als nur eine Fingerübung zur Kartierung von Zellen“, sagt Rajewsky, der die Forschungsgruppe „Systembiologie von Gen-regulatorischen Elementen“ leitet. Mithilfe der interaktiven Datenbank Drosophila Virtual Expression eXplorer (DVEX) können Forscherinnen und Forscher sich irgendeines von etwa 8.000 exprimierten Genen in jeder Zelle anschauen und fragen: „Gen X, wo und in welchem Umfang bist Du gerade aktiv? Auf welche anderen Gene trifft das in der gleichen Zelle ebenfalls zu?“  Das funktioniert auch für die rätselhaften langen nicht-kodierenden RNAs. „Um neue regulatorische Elemente zu identifizieren und sogar Ideen für biologische Mechanismen zu bekommen, können Forscher nun virtuelle Experimente machen statt zeitraubender In-situ-Hybridisierungen im Labor“, sagt Rajewsky. „Was mit den Standard-Methoden Jahre dauern würde, kann man nun in ein paar Stunden erledigen.“

In ihrer Studie beschreiben die MDC-Forscherinnen und Forscher etwa ein Dutzend neue Transkriptionsfaktoren und deutlich mehr lange nicht-kodierende RNAs, die zuvor noch nie untersucht worden waren. Sie schlagen auch eine mögliche Antwort auf eine Frage vor, die die Wissenschaft seit 35 Jahren vor ein Rätsel stellt: Wie schafft es der Embryo, die Synchronizität der ersten Zellteilungen zu durchbrechen, um komplexere Strukturen zu bilden?

Während der Gastrulation, einer frühen Phase der embryonalen Entwicklung, bilden sich die Keimblätter. Das Schicksal der einzelnen Zellen – zu welchen Geweben und Organen sie sich differenzieren können – wird festgelegt. „Wir glauben, dass der Signalweg Hippo zumindest teilweise dafür verantwortlich ist, die Gastrulation vorzubereiten“, sagt Rajewsky. Der Signalweg kontrolliert die Größe von Organen, von Zellzyklen und -vermehrung. Er wurde aber noch nie mit der Entwicklung des frühen Embryos in Zusammenhang gebracht. „Wir haben nicht nur gezeigt, dass Hippo in der Fliege aktiviert ist. Wir konnten sogar vorhersagen, in welchen Teilen des Embryos er das Einsetzen der Mitose beeinflusst und damit die Synchronizität durchbricht. Und das ist nur ein Beispiel dafür, wie nützlich unser Werkzeug für das Verständnis von Mechanismen ist, die traditionellen Ansätzen entgangen sind.“

Eine komplizierte Geburt

Als die Forscherinnen und Forscher die Arbeit am virtuellen Embryo begannen, war unklar, ob das Projekt überhaupt technisch durchführbar war. Eine Säule ihres Erfolgs ist die Drop-Seq-Technologie. Diese neue, auf Tröpfchen basierende Mikrofluidik-Methode ermöglicht es, Transkriptom-Profile von Tausenden Einzelzellen zu einem niedrigen Preis zu gewinnen. Ein Student, Jonathan Alles, hatte sie im Labor von Rajewsky eingerichtet.

Allerdings mussten die Fliegenembryonen genau zu Beginn der Gastrulation ausgesucht werden. Philipp Wahle, ein Doktorand im Labor von Robert Zinzen, hat etwa 5000 von Hand verlesen und sie in einzelne Zellen aufgetrennt. „Ich war davon überzeugt, dass wir damit einen großen und einzigartigen Datensatz gewinnen werden. Das war eine große Motivation“, sagt Wahle. Der mühselige Prozess schaffte eine neue Herausforderung. „Man braucht mehrere Tage, bis genug Material für eine Sequenzierung vorhanden ist“, sagt Christine Kocks, die das Einzelzell-Sequenzierungsteam leitete. Es bestand aus Jonathan Alles, Salah Ayoub und Anastasiya Boltengagen, die gemeinsam mit Nikos Karaiskos die Tröpfchen-basierte Sequenzierung optimierten. „Wir mussten also einen Weg finden, um die Transkriptome in den Zellen zu stabilisieren“, fügt Kocks hinzu. „Schließlich schlug Nikolaus vor, Methanol zu verwenden – basierend auf seinen früheren Arbeiten mit C. elegans-Embryonen.“ Die neue Methode zur Einzelzell-Fixierung wurde im Mai 2017 in BMC Biology vorgestellt.

Während die Daten immer besser wurden, stand Nikos Karaiskos, ein theoretischer Physiker und Bioinformatiker in Rajewskys Labor, vor einer anderen Herausforderung. Kein bereits existierender Ansatz eignete sich dafür, die Zellen räumlich zu ordnen und den Drosophila-Embryo zu rekonstruieren. „Ich habe die Daten immer und immer wieder gefiltert, um sie zu verstehen und die Zellen zu kartieren. Der Prozess änderte sich etliche Male auf dem Weg zum Ziel“, sagt Karaiskos. Es gab viel Austausch zwischen Informatik und Forschungslabor, so wie es charakteristisch für das BIMSB ist. “Ich musste meine Arbeit die ganze Zeit in Frage stellen, schauen, was fehlt und wie man es besser machen kann.“  Er entwickelte schließlich einen Algorithmus namens DistMap, der Transkriptom-Daten von Zellen so kartieren kann, dass sie im virtuellen Embryo an ihrer ursprünglichen Position zu finden sind.

Durch unerschlossenes Terrain navigieren

Der virtuelle Embryo erlaubte es Karaiskos, schnell und leicht die Expression Tausender Gene vorherzusagen – eine beinahe unmögliche Aufgabe mit herkömmlichen Experimenten. Unterstützt von Claudia Kipar bestätigte dann Philipp Wahle die Vorhersagen im Labor mit einem traditionellen Ansatz: In-situ-Hybridisierungen zeigen die Gen-Expressions-Profile mit farbigen Mustern, die unter dem Mikroskop sichtbar sind. „Zu diesem Zeitpunkt umfängt eine einzelne Zell-Lage den gesamten Taufliegen-Embryo“, sagt Wahle. „Deshalb kann man die Zellen gut erreichen und die errechneten Daten mit den Mustern vergleichen.“

Zum ersten Mal war es möglich, etwa 6000 Zellen eines Embryos einzeln anzuschauen, ihre Genexpressionsmuster zu beurteilen – und zu verstehen, was ihr Verhalten im Embryo festlegt. „Der wichtigste technologische Fortschritt dieser Studie ist, dass die räumliche Auflösung nicht verloren geht. Denn diese Dimension ist nötig, schließlich arbeiten embryonale Zellen orchestriert im Raum zusammen“, sagen die Wissenschaftler. „Das ist unerschlossenes Terrain. Man braucht dafür neue bioinformatische Methoden, um die gesammelten Daten zu verstehen.  Das hat in unserer Zusammenarbeit hervorragend geklappt, nicht zuletzt weil das Team von Nikolaus Rajewsky dank seiner Zusammensetzung die Ansätze aus Labor und Bioinformatik verbindet.“  Ein bedeutender Vorteil war, dass beide Gruppen nicht nur an Technologie interessiert sind, sondern sie biologische Fragestellungen lösen wollen, sagt Rajewsky. „Robert hat ein sehr fundiertes Wissen der Entwicklungsbiologie. Wir beherrschen die Sequenzierung von Einzelzellen umgehen und besitzen die Computer-Expertise, um die passenden analytischen Verfahren und Algorithmen zu entwickeln. Solche neuen Algorithmen können uns helfen, die der frühen Entwicklung zugrundlegende Gen-regulatorischen Interaktionen aufzuklären und wirklich zu verstehen.“

Die Gruppen planen bereits die nächsten Projekte. Ein Beispiel wäre, die Kartierung zu verschiedenen Zeitpunkten zu wiederholen. So könnte man die Zusammenarbeit der Zellen beobachten, wenn sie Organe formen. Zudem wollen die Forscherinnen und Forscher testen, ob die Kartierung auch bei komplexeren Geweben funktioniert.

 

Karaiskos, N. et al. (2017): “The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.” Sciencedoi:10.1126/science.aan3235

 

Kontakt

Jana Schlütter
Max-Delbrück-Centrum (MDC)
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